電化學發(fā)光免疫分析機理及其應用

電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種集電子發(fā)光技術、納米微粒子技術、生物素-親和素系統(tǒng)、抗原-抗體免疫反應、電磁場分離整合為一體的自動化標記免疫分析系統(tǒng)，是電化學發(fā)光和免疫測定的結合。ECLIA常用磁珠微球作為固相載體，三聯(lián)吡啶釕[ Ru（bpy）₃]²⁺作為發(fā)光物質(zhì)，由電極激發(fā)，在三丙胺參與下迅速穩(wěn)定發(fā)光，使檢測結果穩(wěn)定可靠，其精密度、準確度均優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。ECLIA既具有發(fā)光檢測的高度靈敏性，又具有免疫分析的高度特異性，整個反應過程在全自動化封閉體系中進行，無人為操作誤差影響。ECLIA具有無放射性、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單、易標記、可實現(xiàn)在線分析等優(yōu)點而備受關注，并且適用于對生物組織、體液等復雜生物樣品中極低含量的生化物質(zhì)及藥物分析，因此在免疫分析研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。

ECLIA與其他幾種標記技術相比，具有許多優(yōu)點：

1）無放射性輻射危害，是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應；
2）靈敏度高，檢測線性范圍在6個數(shù)量級，下限值為1pmol，達到或超過放射免疫分析（RIA）水平；
3）檢測速度快，僅需幾分鐘到十幾分鐘；
4）穩(wěn)定性好，自動化程度高，可直接使用液體試劑；
5）應用范圍寬，既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原、抗體，又可用于核酸探針檢測。

1.電化學發(fā)光原理

電化學發(fā)光免疫分析包括了電化學反應和化學發(fā)光兩個過程。二價的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）₃]²⁺作為標記物，有標記物的生物分子與配體發(fā)生特異的結合反應后，進入流動測量室，此時電發(fā)光過程被啟動。

1）電化學反應過程：在一定的電壓作用下，[Ru（bpy）₃]²⁺釋放電子成為[Ru（bpy）₃]³⁺，同時電極表面的三丙胺（TPA）也釋放電子成為陽離子自由基 TPA+，并迅速自發(fā)脫去一個質(zhì)子而形成三丙胺自由基TPA·；

2）化學發(fā)光過程：具有強氧化性的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）₃]³⁺和具有強還原性的三丙胺自由基TPA·發(fā)生氧化還原反應，結果使[Ru（bpy）₃]³⁺還原成激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）₃]^2+*，然后它以熒光機制衰變釋放出一個波長為620nm光子的能量，而成為基態(tài)的[Ru（bpy）₃]²⁺；

3）上述化學發(fā)光過程后，反應體系中仍存在二價的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）₃]²⁺和三丙胺（TPA），電極表面的電化學反應和化學發(fā)光過程可以循環(huán)進行。通過上述的循環(huán)過程，測定信號不斷地放大，檢測靈敏度大大提高，故電化學發(fā)光檢測具有高靈敏的特點；

4）上述的電化學發(fā)光過程產(chǎn)生光信號的強度與[Ru（bpy）₃]²⁺的濃度成線性關系。將[Ru （bpy）₃]²⁺與免疫反應體系中的一種物質(zhì)結合，經(jīng)免疫反應、分離后，檢測免疫反應體系中剩余二價的三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）₃]²⁺經(jīng)上述過程后所發(fā)出的光，即可得知待檢物的濃度。

2.電化學發(fā)光體系

1）Ru（bpy）₃⁺和Ru（bpy）₃³⁺的湮滅ECL

通過階越脈沖電位法改變電極電位產(chǎn)生氧化態(tài)Ru（bpy）₃³⁺和還原態(tài)Ru（bpy）₃⁺，這兩種物質(zhì)經(jīng)過擴散相互接觸之后，發(fā)生氧化還原反應，生成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）₃^2+*，Ru（bpy）₃^2+*衰減回落至基態(tài)產(chǎn)生ECL。整個過程遵循單重態(tài)電化學發(fā)光路徑（S-route）。

湮滅ECL反應過程

Fig.1 湮滅ECL反應過程

2）還原氧化型ECL

當電極施加一個合適的還原電位時，Ru（bpy）₃²⁺被還原成Ru（bpy）₃⁺，同時另一共反應物如過硫酸根離子（S₂O₈^2-）被還原形成具有強氧化能力的中間體，該中間體可將Ru（bpy）₃⁺氧化產(chǎn)生激發(fā)態(tài)Ru（bpy）₃^2+*，引發(fā)ECL。

還原氧化型ECL反應過程

Fig.2 還原氧化型ECL反應過程

早期對氧化還原型電化學發(fā)光反應的研究僅限于有機相，因為在較低還原電位的作用下，常用金屬電極在水溶液中的析氫現(xiàn)象嚴重制約了Ru（bpy）₃²⁺-SO₄^-體系，拓展了水溶液中還原氧化型電化學發(fā)光反應的應用與研究。

3）氧化還原型ECL

與還原氧化反應相反，當在電極上施加一個合適的氧化電位時，Ru（bpy）₃²⁺在電極表面被氧化產(chǎn)生Ru（bpy）₃³⁺，它可和溶液中的其他還原劑反應得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）₃^2+*，從而產(chǎn)生ECL。目前研究較充分且應用廣泛的還原劑是三丙胺（TPrA），它與三聯(lián)吡啶釕氧化還原電化學發(fā)光的機理主要有以下三種：

①　Ru（bpy）₃²⁺在電極表面被氧化形成Ru（bpy）₃³⁺，而TPrA在電極表面被氧化生成TPrA+·，它脫去質(zhì)子形成強還原性的TPrA·后，TPrA·可將Ru（bpy）₃³⁺還原得到激發(fā)態(tài)Ru（bpy）₃^2+*，產(chǎn)生ECL。

②　具有強還原性的TPrA·不僅可以還原Ru（bpy）₃³⁺，同時還可還原溶液中Ru（bpy）₃²⁺產(chǎn)生Ru（bpy）₃⁺，而Ru（bpy）₃⁺又可以和Ru（bpy）₃³⁺通過湮滅機理產(chǎn)生ECL

③　當TPrA濃度遠大于Ru（bpy）₃²⁺時（約10⁴-10⁵倍過量），僅在0.9V的氧化電位下就可觀察到ECL。TPrA在電極上失去一個電子形成具有一定氧化能力的TPrA⁺，TPrA⁺一方面可轉(zhuǎn)變?yōu)門PrA·并與Ru（bpy）₃²⁺反應生成Ru（bpy）₃⁺；另一方面TPrA+又可充當氧化劑，把生成的Ru（bpy）₃⁺氧化為激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）₃^2+*從而產(chǎn)生ECL。

還原氧化型ECL的三種反應過程

Fig.3 還原氧化型ECL的三種反應過程

4）溶解氧陰極電化學發(fā)光反應機理

基于水溶液中氧氣還原的陰極電化學發(fā)光機理是與以上介紹的湮滅電化學發(fā)光反應機理、還原氧化型和氧化還原型電化學發(fā)光反應機理完全不同的，因為陰極電化學發(fā)光反應并不涉及Ru（bpy）₃²⁺在電極上的直接氧化，而電極反應主要是水溶液中氧氣的還原，還原產(chǎn)物為強氧化性物質(zhì)，這些物質(zhì)可使溶液中Ru（bpy）₃²⁺氧化變?yōu)镽u（bpy）₃³⁺，并且最終通過湮滅反應形成激發(fā)態(tài)Ru（bpy）₃^2+*，產(chǎn)生ECL信號。

3.ECLIA在醫(yī)學檢測中的應用

1）傳染疾病病原體診斷

目前大多數(shù)實驗室采用ELISA和膠體金法對病原體進行檢測，但對于低濃度樣本，檢測時常因方法學的原因造成靈敏度低，導致臨床出現(xiàn)漏檢，并且由于影響檢測的因素較多，尤其是灰區(qū)附近的樣本測定結果差異大，導致重復性差。膠體金雖然操作簡單，但靈敏度較低，臨床漏檢率相對較高。以艾滋?。℉IV）檢測為例，國內(nèi)HIV感染的臨床診斷以血清病毒抗體檢測為主，運用ECLIA測定血清HIV的整個檢測過程中是在封閉流動系統(tǒng)中進行，極大地降低了交叉污染，測定結果不僅快速、準確、可靠，完成單個樣品分析時間也大大縮短，且特異性、精密度均優(yōu)于ELISA并克服了鉤狀效應等假陰性現(xiàn)象，可批量上機進行自動化分析。

2）蛋白質(zhì)和激素檢測

目前激素的檢測多為RIA與ELISA，前者會造成生物損害及環(huán)境污染，后者的反應底物具有毒性且檢測結果受溫度和pH值的影響較大。用ECLIA替代RIA與ELISA可在避免上述危害的同時給臨床診斷、治療和預后提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。ECLIA可對甲狀腺激素、性激素等多種激素進行測定，以糖尿病中的胰島素為例，ECLIA可動態(tài)檢測低濃度范圍的胰島素水平，相較于其他方法來說ECLIA是一種非常靈敏可信且沒有放射污染的均質(zhì)分析方法。

ECLIA測定血清肌酸激酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白和地高辛等，有利于診斷早期心肌梗死等心肌損傷性疾?。粰z測黃體生成素、促卵泡生成素、雌二醇、孕酮、催乳素、睪酮等，可利于診斷早期生殖系統(tǒng)疾病；檢測胰島素、胰島素樣生長因子，有利于糖尿病早期診斷；還可用于血清T3、T4、FT3、FT4等甲狀腺激素的測定。

3）腫瘤診斷

隨著腫瘤基礎理論的發(fā)展，新檢測手段和技術大量涌現(xiàn)。腫瘤標志物在腫瘤診治中的重要作用已被學術界所公認，目前主要用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，如前列腺特異性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）能用于普查無癥狀的腫瘤病人、腫瘤的鑒別診斷與分期、預后判斷、療效觀測與判別復發(fā)的指標。ECLIA因其出色的靈敏度與無放射性污染在腫瘤標志物檢測中逐步取代其它檢測方法。

ECLIA可對良性及惡性腫瘤患者進行體外早期輔助診斷，可以免除腫瘤介入檢查的高費用，同時還可針對檢測血中的癌胚抗原和腫瘤相關糖蛋白抗原進行結腸癌、胃癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)及卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌等婦科癌癥的診斷。此外ECLIA還可檢測血清HCG，適用于早孕和宮外孕診斷。

4）檢測細胞因子及基因

體內(nèi)細胞因子種類繁多，但含量均較少，常規(guī)檢測方法難以得到準確結果，運用ECLIA可以很好的解決這一不足。ECLIA可用于測定腦內(nèi)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子（TNF），也可用于測定T細胞中γ-干擾素水平及血清、細胞培養(yǎng)液中多種白細胞介素的含量。

參考文獻

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