基于NGS的分子診斷

分子診斷是應(yīng)用分子生物學(xué)方法，通過(guò)檢測(cè)受檢個(gè)體或其攜帶病毒、病原體的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或含量變化而做出診斷的技術(shù)，而基于下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）的分子診斷被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。相比于免疫診斷技術(shù)，NGS在發(fā)現(xiàn)未知基因、液體活檢方面具有優(yōu)勢(shì)，但目前存在明顯局限性，如對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施要求高、結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性存在問(wèn)題等。

1. NGS概述

自Sanger測(cè)序后，NGS技術(shù)顯著發(fā)展，可提供更高的數(shù)據(jù)輸出、效率和應(yīng)用。將DNA（或cDNA）隨機(jī)片段化、加接頭，制備測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的克隆進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的信號(hào)，最終獲取序列信息。NGS在處理大規(guī)模樣品時(shí)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，成為目前組學(xué)研究的主要技術(shù)。

Fig.1 NGS基本流程

1.1 文庫(kù)制備

NGS的先決條件是高質(zhì)量的文庫(kù)。文庫(kù)制備首先需獲得與測(cè)序所需分子相對(duì)應(yīng)的模板，然后制備片段使其與所使用的測(cè)序平臺(tái)兼容。測(cè)序可分為DNA測(cè)序（DNA-Seq）和RNA測(cè)序（RNA-Seq）。文庫(kù)大小是由插入片段（接頭序列之間的文庫(kù)部分）大小決定的，最佳插入片段長(zhǎng)度是由NGS設(shè)備以及特定測(cè)序應(yīng)用決定的。

1.1.1 DNA文庫(kù)制備

根據(jù)測(cè)序模板，DNA-Seq可以包括全基因組測(cè)序（WGS）、全外顯子組測(cè)序（WES）、表觀基因組測(cè)序或靶向測(cè)序（TS）。模板制備包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和基于雜交捕獲的方法。

• PCR常用于制備TS模板。在早期階段，擴(kuò)增子測(cè)序側(cè)重于有限數(shù)量的基因或外顯子（短程PCR）。長(zhǎng)程PCR（LR-PCR）的出現(xiàn)使鳥(niǎo)槍測(cè)序（對(duì)隨機(jī)斷裂的、比擴(kuò)增子短的片段進(jìn)行測(cè)序）成為一種主要方法。因此，LR-PCR改善了短擴(kuò)增子測(cè)序中出現(xiàn)的序列模糊問(wèn)題。
• 雜交捕獲常用于制備WES和TS模板，其中互補(bǔ)的生物素化探針與目標(biāo)區(qū)域雜交，使用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行分離。與PCR相比，這種富集方法對(duì)于較大基因組區(qū)域是一種經(jīng)濟(jì)高效的方法，同時(shí)減少了等位基因丟失。

DNA-Seq文庫(kù)構(gòu)建涉及片段化、末端修復(fù)、接頭連接和大小選擇的核心步驟。DNA片段化將DNA剪切成最佳的特定尺寸范圍，三種斷裂方法包括物理（即超聲處理）、酶促（即斷裂酶或轉(zhuǎn)座酶破碎）或化學(xué)（二價(jià)金屬陽(yáng)離子加熱）方法。較小的片段有助于高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，而較長(zhǎng)的片段則提供遠(yuǎn)端相位信息。

起始DNA被片段化后，會(huì)使用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及Klenow片段三種酶的混合物進(jìn)行末端補(bǔ)平和5'端磷酸化。3'端利用Taq DNA聚合酶或Klenow片段加A尾。片段化后產(chǎn)生5'/3'黏性末端及平末端，粘性末端都需轉(zhuǎn)化為平末端。在使用TA連接的方式進(jìn)行接頭連接時(shí)，DNA片段在5'端磷酸化后使用Taq DNA聚合酶在3'端加“A”與帶“T”黏性末端的接頭互補(bǔ)配對(duì)。接頭連接后，PCR富集通常與文庫(kù)制備步驟相結(jié)合。PCR通常使用高保真聚合酶，該酶具有5'→3'聚合酶活性，可沿5'→3'方向合成DNA，同時(shí)具有的3'→5'核酸外切酶活性，可去除新合成的DNA鏈或引物3'端的不匹配堿基。

1.1.2 RNA-seq文庫(kù)制備

對(duì)于RNA文庫(kù)，需要根據(jù)測(cè)序目的進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建方案的篩選。如果目的是發(fā)現(xiàn)復(fù)雜全面的轉(zhuǎn)錄，文庫(kù)需要覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，包括編碼、非編碼、反義及基因間RNA。RNA-Seq對(duì)于功能基因組研究非常有用，例如差異基因表達(dá)、選擇性剪接和變異發(fā)現(xiàn)。RNA-Seq可分為全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（WTS）、mRNA測(cè)序（mRNA-Seq）和小RNA測(cè)序（smRNA-Seq）。樣品制備一般包括三個(gè)步驟：總RNA分離、靶RNA富集以及RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。

cDNA合成

RNA需經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的第一條鏈，因RNA極易被環(huán)境中存在的RNase降解，在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中使用RNase Inhibitor可以抑制這些酶的活性，保護(hù)RNA不被RNase降解。與此同時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶將模板RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，能夠以RNA為模板，按5'→3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，也就是cDNA第一鏈。

cDNA第二鏈合成時(shí)，RNase除去RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈，配合DNA聚合酶催化合成。DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性，可在模板和引物的作用下，沿5'→3'方向合成與cDNA一鏈互補(bǔ)的序列。隨后進(jìn)行末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴(kuò)增最終產(chǎn)生cDNA文庫(kù)。

2. NGS的臨床應(yīng)用

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，臨床應(yīng)用上對(duì)NGS的需求越來(lái)越大，病原學(xué)診斷、檢測(cè)與遺傳病、腫瘤等疾病的精準(zhǔn)診斷等應(yīng)用領(lǐng)域?qū)GS的要求也越來(lái)越高。在發(fā)生的幾次世界性范圍的傳染性疫情中，NGS技術(shù)也逐漸扮演起重要的角色。

2.1 臨床微生物病原學(xué)診斷

人體中有著由細(xì)菌、真菌、病毒等微生物組成的龐大而復(fù)雜的胃腸道系統(tǒng)，且人體許多疾病的發(fā)生都與微生物系統(tǒng)的失調(diào)或微生物入侵有著極其緊密的關(guān)系，而NGS技術(shù)的出現(xiàn)為這些微生物菌群的鑒定檢測(cè)與研究提供了有力的技術(shù)支持。

2.2 臨床微生物耐藥診斷

臨床上，醫(yī)院獲得性感染的細(xì)菌用藥治療一直是醫(yī)療難點(diǎn)，主要是由于在長(zhǎng)期的抗生物用藥篩選中，許多病原體通過(guò)基因突變獲得對(duì)不同抗生素的耐藥性，給臨床治療造成了極大影響。目前，通過(guò)高通量測(cè)序深度挖掘并組建藥學(xué)相關(guān)微生物組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)超過(guò)60種藥物與微生物之間存在相互作用。后期高通量測(cè)序也可持續(xù)挖掘微生物耐藥性、微生物與藥物間相互作用及其與人類遺傳變異的相關(guān)性。

2.3 臨床腫瘤診治

在癌癥預(yù)防上，高通量測(cè)序平臺(tái)可以用于腫瘤基因的突變篩查，指導(dǎo)癌癥的防控工作；在癌癥治療上，通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)挖掘與癌癥相關(guān)的基因，不僅可以發(fā)掘與癌癥相關(guān)的診斷靶標(biāo)，還可以發(fā)掘與之相關(guān)的治療靶點(diǎn)，為臨床提供具體的個(gè)性化用藥指導(dǎo)。

2.4 遺傳疾病診斷檢測(cè)

NGS的另一項(xiàng)較為重要的應(yīng)用是遺傳性疾病的檢測(cè)診斷，主要包括遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷及植入性胚胎遺傳學(xué)診斷。對(duì)產(chǎn)婦進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT），然后對(duì)基因檢測(cè)異常的產(chǎn)婦羊水或臍帶血細(xì)胞進(jìn)行染色體Ｇ顯帶檢測(cè)和熒光原位雜交檢測(cè)，作為確診標(biāo)準(zhǔn)。NGS為遺傳性疾病診斷、新生兒疾病早期診斷、產(chǎn)婦無(wú)創(chuàng)檢測(cè)都提供了極大的便利，在遺傳性疾病的治療與預(yù)防方面呈現(xiàn)出很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1. NGS平臺(tái)的臨床應(yīng)用

參考文獻(xiàn)

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• 化學(xué)修飾熱啟動(dòng)Taq酶
• 抗體修飾熱啟動(dòng)Taq酶
• SRT逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）
• 高保真PCR預(yù)混液（PCR Master Mix）
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