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化學發(fā)光免疫分析平臺

發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后,由基態(tài)(較低能級)躍遷到激發(fā)態(tài)(較高能級),然后在返回到基態(tài)并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同發(fā)光可以分為光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光。

化學發(fā)光(chemiluminescence,CL)是指伴隨化學反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)分子,如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)在進行化學反應(yīng)時,由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學能,使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài),受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時,便發(fā)出一定波長的光?;瘜W發(fā)光分析方法主要是依據(jù)化學發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理,利用儀器對體系化學發(fā)光強度進行檢測,而確定待測物含量的一種痕量分析方法。

1977年,Halman等將化學發(fā)光與抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合,創(chuàng)建了化學發(fā)光免疫分析方法(chemiluminescent immunoassay,CLIA),相較于傳統(tǒng)免疫技術(shù)(放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)等),CLIA具有自動化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢。

化學發(fā)光免疫分析方法類型及其原理

CLIA包含兩個部分,即化學發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫反應(yīng)系統(tǒng)?;瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發(fā)態(tài)的中間體,當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時,同時發(fā)射出光子(hν)利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原或抗體上,或酶作用于發(fā)光底物?;瘜W檢測系統(tǒng)通過光電信號檢測儀檢測發(fā)光強度,最后通過化學發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關(guān)系確定被測物的含量。

CLIA根據(jù)標記物的不同可分為三大類,即直接化學發(fā)光免疫分析、酶促化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析。

直接化學發(fā)光

化學發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的免疫測定方法稱為化學發(fā)光免疫分析。直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需要酶的催化作用,直接參與發(fā)光反應(yīng),他們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團,可直接標記抗原或抗體,目前常見的直接化學發(fā)光標記物主要有吖啶酯類化學發(fā)光劑。
直接化學發(fā)光

用吖啶酯直接標記抗體,與待測標本中相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復(fù)合物,這時只需加入氧化劑(H202)和NaOH使成堿性環(huán)境,吖啶酯即可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能,這部分光的積分與待測抗原的量成正比,可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。

直接化學發(fā)光速度快、試劑穩(wěn)定性好,但靈敏度略低于酶促發(fā)光。

酶促化學發(fā)光

酶促化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLELA)是以酶標記抗原或抗體進行免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定,酶的濃度決定了化學發(fā)光的強度。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為化學發(fā)光酶免疫分析常用的標記酶,發(fā)光底物以魯米諾、AMPPD為代表。

發(fā)光物質(zhì) 激活酶 特點
魯米諾及其衍生物 HRP 閃光型,在使用增強劑的情況下,發(fā)光的持續(xù)時間可延到30~60min,強度至少增加100倍以上。
通常采用Luminol/H2O2/HRP體系,化學發(fā)光反應(yīng)2min后,光反射強度達到最高峰;20min后,光強度減少20%
AMPPD ALP 在堿性環(huán)境下,AMPPD本底低;
熱穩(wěn)定性好,在pH=7.0的水中,30℃時的分解半衰期為142h;
發(fā)光為輝光型,波長為470nm,在15min時強度達到高峰,15~60min內(nèi)光信號強度維持一致,變化很小;
加入增強劑能明顯增強發(fā)光強度,達100~100,000倍

魯米諾+HRP發(fā)光體系

HRP-CLEIA體系具有發(fā)光時間短(幾秒內(nèi)瞬時閃光),發(fā)光強度低、不易測量等缺點,為了解決這一問題,通常在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光增強劑。發(fā)光增強劑主要作用為放大光輸出,增強光信號,提高發(fā)光持續(xù)性,從而提高分析靈敏度和可重復(fù)性。

該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體,在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成固相包被抗體-待測抗原-酶(HRP)標記抗體復(fù)合物,這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。

魯米諾+HRP發(fā)光體系

ALP+AMPPD發(fā)光體系

堿性磷酸酶(ALP)和1,2-二氧環(huán)己烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的化學發(fā)光體系,其中最具代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。該反應(yīng)體系以堿性磷酸酶標記抗體,在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物,這時加入AMPPD發(fā)光劑,堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。

ALP+AMPPD發(fā)光體系

電化學發(fā)光免疫分析

在電極上施加一定的電壓或電流時,在電極電化學反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學反應(yīng)而產(chǎn)生激發(fā)態(tài),當激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時放出能量,此過程即為電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)。電化學發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA)是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體,以三丙胺(TPA)為電子供體,在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng),它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。

電化學發(fā)光免疫分析

在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中,磁性微粒為固相載體包被抗體,用三聯(lián)吡啶釕標記抗體,在反應(yīng)體系內(nèi)待測標本與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復(fù)合物,這時將上述復(fù)合物吸入流動室,同時引入TPA緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時,被安裝在電極下面的電磁鐵吸住,而未結(jié)合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓,啟動電化學發(fā)光反應(yīng),使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生電化學發(fā)光,光的強度與待測抗原濃度成正比。

三種化學發(fā)光免疫分析方法的比較

  直接化學發(fā)光 酶促化學發(fā)光 電化學發(fā)光
標記物 吖啶酯 HRP 三聯(lián)吡啶釕
反應(yīng)類型 夾心法、競爭法 夾心法、競爭法 夾心法、競爭法
光信號 閃光 輝光 電激發(fā)閃光
簡便快速 快速 較快速 快速
影響結(jié)果的因素 較多
可否半自動開放 可以
檢測成本
發(fā)光底物 NaOH 金剛烷、普米諾 電激發(fā)

化學發(fā)光、時間分辨熒光、酶免疫分析對比

  化學發(fā)光 時間分辨熒光 酶免疫分析
示蹤物 吖啶酯、酶、三聯(lián)吡啶釕
測量信號 單光子 熒光 比色
最小檢出值 10-15mol 10-15mol 10-9mol
可否提高靈敏度 可以 可以
完成操作流程
成本 較高
試劑盒有效期 半年到更長 1年 半年

臨床應(yīng)用

CLIA具有特異性強、靈敏度高、準確、操作簡單、快速等優(yōu)點,它將化學分析方法和免疫學分析方法的優(yōu)點融合了起來,已經(jīng)被廣泛用于生命科學、環(huán)境科學、臨床醫(yī)學和生理學等領(lǐng)域。常見的臨床醫(yī)學應(yīng)用有:

甲狀腺激素檢測;
生殖激素檢測;
垂體激素和皮質(zhì)激素檢測;
貧血因子檢測;
腫瘤標志物檢測;
感染性標志物檢測;
感染性疾?。?br /> 糖尿病、胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等;
心臟標志物檢測;
病毒標志物檢測;
過敏性疾病;
治療藥物檢測;

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