時(shí)間分辨熒光

免疫熒光是一種將抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與生物標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，在科研及臨床上有著廣泛的應(yīng)用。普通的免疫熒光技術(shù)在對(duì)抗原含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)存在一定的局限性，在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，用普通熒光素來(lái)檢測(cè)生物樣品時(shí)，蛋白質(zhì)本身產(chǎn)生的熒光會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的靈敏度嚴(yán)重下降。為了解決這一問(wèn)題，1983年SOINI和KOJOLA提出以鑭系元素標(biāo)記為示蹤螯合物和熒光測(cè)量相結(jié)合，建立了時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)。時(shí)間分辨方式的免疫熒光分析方法可以對(duì)蛋白質(zhì)、酶以及同位素等物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并且不再受檢測(cè)物種自然熒光的干擾。

技術(shù)原理

鑭系元素共有15中，常用的有4中：釤（SM），銪（Eu），鏑（Dy）,锝（Te）。鑭系元素的半衰期很長(zhǎng)（介于10-1000us之間，背景物質(zhì)的半衰期為1-10ns），利用鑭系元素的熒光特點(diǎn)，通過(guò)延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，在待測(cè)樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后再進(jìn)行檢測(cè)，即可將特異性熒光與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái)。

熒光信號(hào)衰變時(shí)間對(duì)比

圖1：熒光信號(hào)衰變時(shí)間對(duì)比

在POCT領(lǐng)域，免疫熒光平臺(tái)最常用的就是時(shí)間分辨免疫熒光，其實(shí)驗(yàn)原理如下：當(dāng)將含有待測(cè)抗原（抗體）的樣品滴在加樣區(qū)，待測(cè)樣品中的抗原（抗體）與結(jié)合墊中的熒光納米微球標(biāo)記的抗體（抗原）結(jié)合并通過(guò)毛細(xì)作用向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測(cè)區(qū)后，與檢測(cè)線上固定的抗體（抗原）結(jié)合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測(cè)線上，而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源（365nm）對(duì)檢測(cè)區(qū)掃描檢測(cè)，檢測(cè)線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強(qiáng)度的熒光（615nm），且衰變時(shí)間也較長(zhǎng)。延緩測(cè)量時(shí)間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測(cè)量稀土元素的特異性熒光。通過(guò)檢測(cè)線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱及其比值，即可分析出樣品中待測(cè)物的濃度。

時(shí)間分辨熒光技術(shù)原理

圖2：時(shí)間分辨熒光實(shí)驗(yàn)原理

鑭系元素特點(diǎn)

時(shí)間分辨熒光免疫分析法之所以能夠繼酶免、放免、化學(xué)發(fā)光后成為一種更新、更靈敏的檢測(cè)方法，主要取決于它用鑭系元素物理及化學(xué)性質(zhì)。

壽命長(zhǎng)

鑭系元素?fù)碛袠O長(zhǎng)的熒光衰退時(shí)間（例如銪元素衰退時(shí)間為730000ns，釤元素衰退時(shí)間為50000ns），通過(guò)延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間即可消除實(shí)驗(yàn)的本底干擾。

Stockes位移大

StoKes位移是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長(zhǎng)差。波長(zhǎng)差越大，越容易將兩個(gè)波長(zhǎng)區(qū)分開(kāi)來(lái)，排除干擾。例如銪的激發(fā)光波長(zhǎng)340nm，發(fā)射光波長(zhǎng)613nm，兩者之間的波長(zhǎng)差為273nm，所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分靠。而普通熒光物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長(zhǎng)差為28nm，那就很難排除激發(fā)光對(duì)發(fā)射光的干擾，影響檢測(cè)結(jié)果。

特異性強(qiáng)

鑭系元素的發(fā)射光譜很窄（615±5nm），狹窄的發(fā)射峰，通過(guò)波長(zhǎng)分辨，很容易將特異性與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái)。