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D-二聚體(D-Dimer)免疫檢測及其影響因素

D-二聚體是一種可溶性纖維蛋白降解產(chǎn)物,源自纖溶酶介導(dǎo)的交聯(lián)纖維蛋白降解。因此,D-二聚體可以被認(rèn)為是凝血和纖維蛋白溶解激活的生物標(biāo)志物,通常用于排除靜脈血栓栓塞(VTE)。D-二聚體越來越多地用于評估VTE復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),幫助確定VTE患者抗凝治療的最佳持續(xù)時間、診斷彌散性血管內(nèi)凝血以及篩查VTE風(fēng)險(xiǎn)增加的患者。

1.D-二聚體檢測方法

1.1 多克隆抗體檢測

20世紀(jì)70年代開發(fā)的第一代D-二聚體檢測法,能夠通過多克隆抗體檢測纖維蛋白原和FDP。為了避免血漿中高濃度纖維蛋白原的交叉反應(yīng),這種免疫測定只適用于血清樣本;而且服用抗凝劑的患者會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,在形成凝塊以及降解產(chǎn)物被吸收到凝塊中的樣本會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

1.2 單克隆抗體檢測

20世紀(jì)80年代初,隨著針對D結(jié)構(gòu)域單克隆抗體的引入,D-二聚體檢測的特異性和靈敏度顯著提高。這代免疫測定可以特異性靶向D-二聚體表位,與FDP和纖維蛋白的非交聯(lián)片段的交叉反應(yīng)性極小,因此可以使用血漿樣本。第一代方法主要以定性乳膠凝集免疫測定法為代表,使用抗體包被的乳膠微粒并需要目視檢查凝集反應(yīng)。第二代自動化乳膠凝集免疫測定(或乳膠增強(qiáng)免疫比濁測定)通過D-二聚體的聚集率來定量D-二聚體。添加D-二聚體后,乳膠微粒凝集,從而阻止光穿過溶液。光度計(jì)測得吸光度的增加與D-二聚體濃度成正比。乳膠增強(qiáng)免疫比濁測定速度快,靈敏度與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)相當(dāng)。

1.3 酶聯(lián)免疫熒光分析

20 世紀(jì) 90 年代中期,bioMérieux開發(fā)了一種基于ELISA的熒光終點(diǎn)檢測分析(酶聯(lián)免疫熒光分析(ELFA))。該測定顯示出與微孔板ELISA類似的靈敏度和特異性,具有自動化優(yōu)勢,可以在更短時間(30分鐘)內(nèi)產(chǎn)生更精確的結(jié)果。Vidas?是臨床上最有效的D-二聚體測量技術(shù),是公認(rèn)的商業(yè)參考方法。

1.4 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

最近,化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法顯示出與ELISA和乳膠增強(qiáng)免疫比濁測定法相似的敏感性。磁微粒包被特異性D-二聚體單克隆抗體,用異魯米諾標(biāo)記的抗D-二聚體抗體孵育,產(chǎn)生與D-二聚體濃度成正比的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.5 POC D-二聚體檢測

POC D-二聚體測定能夠快速篩查患者的血栓栓塞性疾病,從而緩解急診壓力,且便于農(nóng)村地區(qū)使用。大多數(shù)POC檢測使用全血,周轉(zhuǎn)時間(TAT)短。在血凝試驗(yàn)中(如:SimplyRED?),二價(jià)抗體對紅細(xì)胞和D-二聚體具有特異性。當(dāng)血液中存在D-二聚體時,紅細(xì)胞發(fā)生凝集并提供定性結(jié)果?;诿庖邔游觯ㄈ鏑learview Simplify?)、熒光(如Vidas?迷你分析儀、Triage?、Stratus CS?)和化學(xué)發(fā)光(如Pathfast?)的檢測方法也存在。一些半定量檢測也在使用(如Dade Dimertest,NyoCard?)。

表1. D-二聚體測定的特點(diǎn)

ELISA ELFA 非增強(qiáng)乳膠比濁 CLIA 增強(qiáng)乳膠比濁 POC
類型 定量 定量 定性/半定量 定量 定量 定性/定量
TAT 2-4h 35-40min 快速 25-40min 15min 2-20min
優(yōu)點(diǎn) 被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)
敏感
不依賴觀察者
作為參考方法
驗(yàn)證方法
靈敏度高
自動化程度高
線性范圍寬
不依賴觀察者
方便
快速
靈敏
快速
自動化
不依賴觀察者
靈敏
快速
自動化
不依賴觀察者
方便
快速
特異性更高
全血
缺點(diǎn) 手動操作
技術(shù)性強(qiáng)
耗時
線性范圍不理想
中等特異性
中等特異性 中等靈敏度
手動
依賴觀察者
缺乏臨床驗(yàn)證
中等特異性
中等特異性 并非所有廠家都得到FDA認(rèn)證
依賴觀察者
手動操作
廠家 Asserachrome?(Stago),
Enzygnost?
(Dade Behring)
Vidas?(bioMérieux) Dimertest latex? (IL),
Fibrinosticon? (bioMérieux), Dade
Dimertest?(Siemens)
AcuStar?(Werfen),
Immulite?(Siemens)
Tina-quant? (Roche),
STA-Liatest? (Stago),
HemosIL HS?(Werfen)
Innovance?
(Dade-Behring)
SimpliRed?(Agen),
Clearview
Simplify?(Agen)

2.影響D-dimer檢測的因素

2.1 分析前變量

在止血實(shí)驗(yàn)室中大多錯誤與分析前活動有關(guān),分析前錯誤出現(xiàn)的頻率為60-70%,這遠(yuǎn)高于分析階段(10-15%)和分析后階段(15-20%)。分析前錯誤主要集中在人工操作環(huán)節(jié)。

Salvagno等人研究了當(dāng)?shù)啬獙?shí)驗(yàn)室2年間檢測到的所有分析前錯誤;發(fā)現(xiàn)最常見的分析前問題與實(shí)驗(yàn)室未收到樣本(49.3%)、溶血(19.5%)、凝血(14.2%)和樣本量不足有關(guān)(13.7%)。Grecu等人研究發(fā)現(xiàn),血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室分析前錯誤43.2%來源于凝血樣本。Dikmen等人在為期1年的類似研究中,發(fā)現(xiàn)拒收樣本主要源于樣本凝固(35%)和體積不足(13%),且凝血測試樣本拒收率(13.3%)高于其他測試(例如生化測試為3.2%,血?dú)夥治鰹?.8%,尿液分析為9.8%)。

2.1.1 止血帶

止血帶通常用于暫時阻塞靜脈血流,幫助抽血醫(yī)生識別靜脈通路。通常建議,針頭進(jìn)入靜脈或第一根管子開始充滿時,立即取下止血帶,止血帶停留時間不超過1-2分鐘。長時間使用止血帶會引起血液濃縮和形成凝塊,影響凝血檢測結(jié)果。Lippi等人觀察到,在靜脈停滯3分鐘后采集的樣本中,D-二聚體值(Mini Vidas?免疫分析儀)增加13.4%。靜息1分鐘后平均增加7.9%。

2.1.2 抗凝劑

臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)和世界衛(wèi)生組織(WHO)建議在絕大多數(shù)止血測試中使用含有3.2%(105-109 mmol/L)緩沖檸檬酸鈉抗凝劑的采集管,不建議使用肝素化/EDTA等會顯著干擾凝塊測定(例如 PT、APTT、FV、FVIII)的抗凝劑。血液與抗凝劑的推薦比例為9/1,異常抗凝比例通常會延長凝血時間(PT、APTT 和 TT),導(dǎo)致D-二聚體和纖維蛋白原估值偏低。

一些商業(yè)化D-二聚體檢測(包括POC檢測)允許使用檸檬酸鹽、肝素化或EDTA血漿(Pathfast?、Tina-quant?(羅氏,瑞士)、AQT-90?(Radiometer,丹麥)、Simplify?(Agen Inc,澳大利亞)),而其他廠家則建議僅使用檸檬酸鹽抗凝血液(例如 Vidas?、BCS?、STA-Liatest?(Diagnostica Stago,Asnières,法國)、Immulite?(西門子,美國)。

2.1.3 溶血

體外溶血是臨床實(shí)驗(yàn)室分析前問題最常見的原因之一?;颊咦陨恚ɡ缛苎载氀⒋x紊亂、傳染源)、抽血(例如針頭尺寸、止血帶時間、外傷性抽血、未混合或劇烈混合血管)、樣品運(yùn)輸(例如PTS、時間、急或重癥監(jiān)護(hù)病房)、處理(例如離心前延遲、樣本重旋、運(yùn)輸時間/溫度)和儲存(例如溫度和持續(xù)時間)都可能造成溶血。CLSI指南H21-A5(血漿凝血試驗(yàn)和分子止血試驗(yàn)血液標(biāo)本的收集、運(yùn)輸和處理)建議不要使用可見溶血的樣品,因?yàn)閾p傷細(xì)胞釋放的促凝因子可能造成實(shí)驗(yàn)偏差。臨床實(shí)驗(yàn)室的大部分溶血標(biāo)本(±95%)僅為輕度溶血(無細(xì)胞血紅蛋白0.3-0.6 g/L)。因此,當(dāng)游離血紅蛋白濃度低于非干擾限度(即< 3g /L)時,D-二聚體值可能仍然是可靠的。

2.1.4 穩(wěn)定性與儲存

雖然D-二聚體主要用于急診和快速測量;但當(dāng)樣品儲存在中心實(shí)驗(yàn)室以及在研究環(huán)境中使用時,需要穩(wěn)定性信息。多項(xiàng)研究表明D-二聚體可能會穩(wěn)定較長時間,目前建議測試前樣品在室溫(15-25℃)下保存不超過4小時。在許多不同的D-二聚體免疫測定中,D-二聚體在室溫(RT)或2-8℃下可穩(wěn)定至少24小時(在血漿/全血中)。此外,有研究表明,凍融程序不會顯著影響D-二聚體檢測結(jié)果。

2.2 分析變量

2.2.1 方法間差異

D-二聚體檢測目前的主要問題就是免疫測定法之間的高度差異性。這種差異與以下幾個因素有關(guān):1)D-二聚體包含交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物的廣泛混合物,2)使用不同的單克隆抗體,3)缺乏國際認(rèn)證的內(nèi)控或校準(zhǔn)品,以及4)單位和臨床界值的使用差異。

2014年,美國病理學(xué)家學(xué)會(CAP)凝血資源委員會在一項(xiàng)涉及3800個實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),方法間變異系數(shù)(CV)高達(dá)42%。根據(jù)UKNEQAS的四份報(bào)告(2017年4月、2017年7月、2017年9月和2018年1月),非FEU和FEU單位的方法間CV(排除異常值后)分別為33.4%、38.2%、41.8%、30.9%和18%、19.3%、17.7%和19%;這四項(xiàng)調(diào)查涉及736至752個實(shí)驗(yàn)室。

2.2.2 校準(zhǔn)品

校準(zhǔn)材料主要通過纖維蛋白凝塊的可控裂解獲得。因此,制造商必須確保裂解是可重復(fù)的,以獲得相同大小的降解產(chǎn)物,因?yàn)闄z測的靈敏度可能會根據(jù)高分子量纖維蛋白原(HMWF)或低分子量纖維蛋白原(LMWF)的相對量而變化。D-二聚體測定可用純化的纖維蛋白片段D-二聚體等同物,或根據(jù)用于制備校準(zhǔn)品的纖維蛋白原量進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.3 分析后變量

2.3.1 計(jì)量單位

D-二聚體單位根據(jù)所用校準(zhǔn)品的類型而變化,目前臨床實(shí)驗(yàn)室使用兩種單位:D-二聚體單位(DDU)和纖維蛋白原當(dāng)量單位(FEU)。FEU將D-二聚體的質(zhì)量與纖維蛋白原的質(zhì)量進(jìn)行比較,校準(zhǔn)品是通過纖溶酶降解純化的纖維蛋白原(存在因子XIII的情況下凝固)制備的。DDU是確定的D-二聚體質(zhì)量,校準(zhǔn)品由純化的D-二聚體組成。最近的研究表明,大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室使用FEU計(jì)量,主要測量單位是mg/L,其次是ng/mL。在可用的測量單位中,μg/L(或ng/mL)最接近國際系統(tǒng)(SI)的單位。需要注意的是使用不同的單位(FEU或DDU,以及不同的測量單位)可能會造成混亂,并導(dǎo)致患者的分類錯誤或誤診。

2.3.2 年齡cut off值

D-二聚體值通常隨著年齡的增長而增加,大部分老年患者的D-二聚體水平高于500μg/L FEU的傳統(tǒng)cut off值?,F(xiàn)在普遍建議使用年齡調(diào)整cut off值(即[年齡調(diào)整cut off值,μg/L FEU] = [年齡(歲)×10])來報(bào)告D-二聚體檢測結(jié)果。使用特定的年齡cut off值能夠大幅提高陽性預(yù)測值(PPV)。

2.3.3 周轉(zhuǎn)時間

周轉(zhuǎn)時間(TAT)是D-二聚體報(bào)告的一個關(guān)鍵方面,因?yàn)镈-dimer檢測主要用于緊急臨床情況。意大利共識文件推薦總體TAT<1小時,這似乎適用于管理絕大多數(shù)緊急測試請求。建議使用線性范圍寬(即高達(dá)5000μg/L),且不進(jìn)行額外稀釋的測定法,以及使用更快且經(jīng)過驗(yàn)證的離心過程、氣動管道系統(tǒng)(PTS)或可靠的POC分析儀,以減少TAT。

3. 關(guān)于D-二聚體檢測的建議

由于不同的D -二聚體免疫檢測(即形式、抗體)的異質(zhì)性和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,在實(shí)施靜脈血栓栓塞管理策略之前,應(yīng)評估當(dāng)?shù)胤椒ǖ姆治龊团R床性能。用于排除VTE的cut off值需要在當(dāng)?shù)卮_認(rèn),根據(jù)英國血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會指南的建議,使用至少200名受試者。可以使用制造商建議的cut off值,前提是已在其他地方進(jìn)行了可靠的驗(yàn)證研究,并且未發(fā)現(xiàn)顯著的批間差異。許多檢測方法(例如 Vidas、AxSYM、STA-Liatest)的cut off值已在前瞻性研究中得到臨床驗(yàn)證。在選擇制造商時,應(yīng)考慮此因素。另外,制造商應(yīng)及時了解有關(guān)其免疫測定法使用的最新文獻(xiàn),在需要時更新cut off值。

D-二聚體檢測的是具有不同分子量的交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物的混合物,不應(yīng)與纖維蛋白原或FDP反應(yīng)。最好也不要與各種酶介導(dǎo)的蛋白水解釋放的纖維蛋白和纖維蛋白原片段反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

Favresse J, Lippi G, Roy PM, et al. D-dimer: Preanalytical, analytical, postanalytical variables, and clinical applications[J]. Crit Rev Clin Lab Sci, 2018, 55(8): 548-577.

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