【文獻分享】一種NT-proBNP替代抗原的成本效益優(yōu)化策略

Ruan Y等人提出了一種構建NT-proBNP替代抗原的策略。以第10人纖維連接蛋白III型（FN3）為蛋白支架，將編碼NT-proBNP兩個抗原表位的堿基序列通過4GS或polyN連接體融合到FN3的FG環(huán)區(qū)和C端，再用大腸桿菌表達系統(tǒng)對融合蛋白（分別命名為FN3-epitopes-4GS和FN3-epitopes-polyN）進行低成本的表達和純化。Western blot分析、ELISA、血清穩(wěn)定性測試和差示掃描量熱分析等一系列檢測結果表明，F(xiàn)N3可用于構建雙抗原表位、且具有良好免疫反應性的穩(wěn)定NT-proBNP替代抗原。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)可高效生產FN3 NT-proBNP替代抗原且成本低，該策略在生物大分子替代抗原的生產方面具有潛在的應用前景。

1.為什么要做NT-proBNP替代抗原

N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）在人血清中的濃度很低，且經常被其他高濃度的蛋白污染，細胞培養(yǎng)成本高且容易降解，因此想要純化天然NT-proBNP制備標準抗原并不容易。

2.為什么選擇FN3做支架蛋白制備替代抗原

第10人纖維連接蛋白III型（FN3）是開發(fā)非抗體結合域特別成熟的支架，被廣泛應用于工程化新型結合蛋白；一些基于FN3的生物分子已被開發(fā)用于臨床治療和診斷。FN3具備以下特點：

1）結構簡單
2）N端或C端非常靈活，可以在不破壞附近結構二級構象的情況下延伸，被認為是一個合理、規(guī)則的抗原表位區(qū)域。
3）不含二硫鍵或游離巰基，有助于其在高溫（Tm =87°C）和還原環(huán)境的穩(wěn)定性。
4）三個靈活的表面環(huán)結構（BC、DE和FG）與抗體可變區(qū)相似，BC和FG環(huán)中氨基酸序列的變化不會影響FN3大分子衍生物的穩(wěn)定性。據(jù)報道，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列可以耐受高度人工引入的序列多樣性，且不會改變衍生物的穩(wěn)定性或溶解度。
5）FN3缺乏半胱氨酸殘基，可在大腸桿菌等細菌的細胞質中高表達。
FN3獨特的結構特征、優(yōu)越的生物物理特性及其與許多分子的相容性為制備檢測試劑盒中穩(wěn)定替代抗原提供了有利條件。

3.設計思路

抗體與靶標的結合大多是高度特異性的。因此，一種抗體只能識別抗原的特定部分——“抗原表位”。抗原表位的展示是體外生產替代抗原的關鍵步驟。研究表明，線性表位與不連續(xù)構象表位不同，是由氨基酸序列而不是三維形態(tài)決定的。因此，將特定的線性抗原表位偶聯(lián)到大分子載體上替代全長抗原作為免疫原是一種可行的方法。目前NT-proBNP免疫的確切線性表位得到了很好的研究，可以通過穩(wěn)定的支架蛋白（如FN3）融合表達NT-proBNP的短線性表位肽，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)以低成本促進生產、純化和檢測。

3.1NT-proBNP表位的選擇

無論是在人類血液中還是在真核細胞中重組表達的NT-proBNP分子，中心部分都存在o糖基化修飾。因此，建議使用NT-proBNP的N端或C端特異性抗體對血清NT-proBNP進行精確定量測量。此外，有報道稱NT-proBNP分子中心部分（28-45和46-60肽）的特異性抗體在免疫測定中很少與人血液樣本中的抗原結合。本研究選取NT-proBNP兩端的表位（線性表位12-21和62-73）工程化FN3。

3.2 NT-proBNP表位插入位點的選擇

選擇FN3晶體結構中相距較遠的C端和FG環(huán)，以減少相鄰兩個抗原表位之間局部構象的影響，還可通過靈活的連接體[如polyN（SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）]將表位分開。

4.核心試驗概述

4.1質粒構建

首先合成編碼支架蛋白FN3的基因（其FG環(huán)和C端被NT-proBNP的兩個表位取代）。通過NcoⅠ和HindⅢ位點克隆到pET28a(+)載體上。此外，編碼4GS連接子或polyN連接子的基因被引入表位62-73上游，產生兩個相似但不同的質粒[命名為pET28a (+)-FN3-epitopes-4GS和pET28a (+)-FN3-epitopes-polyN]。DNA測序結果顯示表位DNA和連接子成功插入質粒。

4.2同源性建模

為了獲得末端線性表位的三維結構，利用RaptorX （http://www.raptorx.uchicago.edu/）進行同源性建模。首先從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（PDB:1FNA）中檢索FN3的氨基酸序列，以作為同源性建模的靶點。利用RaptorX進行蛋白質二級結構預測和基于模板的三級結構建模。最后在PyMOL中對兩個蛋白結構進行比對（The PyMOL Molecular Graphics System，版本1.5.0.3)。

4.3蛋白質的表達和純化

為制備顯示NT-proBNP兩個表位的重組FN3蛋白（簡稱FN3-epitopes），將質粒pET28a(+)-FN3-epitopes-4GS或pET28a(+)-FN3-epitopes-polyN轉入大腸桿菌BL21（DE3）。挑取單個菌落，將培養(yǎng)物以1/100的比例接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。OD600達到0.4-0.6時，加入0.2mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在 25℃搖床上繼續(xù)培養(yǎng)，誘導FN3-epitopes表達，6小時后離心收集細胞。細胞經超聲破碎，12000g離心后即可獲得粗產物。將含有目標蛋白的細胞裂解上清液在40°C下加熱10min。然后高速去除沉淀，獲得上清液，加入到HisTrap™HP中進行純化。通過SDS-PAGE或Western blot分析檢測目標蛋白的表達和純化情況，用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度。

4.4驗證

研究團隊進行了熱變性實驗、Western Blot分析、可溶性蛋白檢測、抗原結合能力的評價、差示掃描量熱法（DSC）及FN3-Epitopes-polyN血清穩(wěn)定性試驗（詳細信息見原文）。

5.結果

5.1FN3-Epitopes的結構

選擇NT-proBNP表位序列12-21和62-73，在FN3空間結構上距離相對較遠的兩個位置（FG環(huán)和C端）分別植入，以避免兩個表位之間可能發(fā)生的相互作用。FN3 FG環(huán)區(qū)氨基酸序列RGDSPASSK被NT-proBNP表位12-21取代，NT-proBNP的62-73表位與FN3的C端重組。此外，在FN3結構域引入polyN （SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）連接子，將NT-proBNP兩個表位融合到FN3結構域，以保證靶蛋白的正常功能，重組蛋白分別命名為FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS（圖1）。額外的連接子KKGKGKKGK，可以促進重組蛋白（FN3-epitopes，即FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes- 4GS）與其他分子的偶聯(lián)，如生物素和過氧化物酶。

圖1. FN3、FN3-Epitopes的部分序列和結構

注：（A）NT-proBNP表位修飾的FN3蛋白部分序列。綠色字母代表FN3的FG環(huán)（RGDSPASSK）區(qū)域或C端（EI），紅色字母代表FG環(huán)插入的NT-proBNP表位12-21 （LETSGLQEQR）或C端插入的表位62-73 （RGHRKMVLYTLR）。灰色字母表示插入的4GS連接子或polyN連接子。（B）FN3的三維結構（青色）和NT-proBNP表位序列重組的FN3建模結構（表位12-21和62-73用紅色線表示），4GS連接子或polyN連接子用深灰色線表示。FN3的骨架是青色的，它與黃色的同源模型重疊。

5.2FN3-Epitopes的表達

重組FN3-epitopes可被針對NT-proBNP不同氨基酸殘基（13-27和61-76）的商業(yè)單克隆抗體識別。SDS-PAGE結果顯示重組蛋白FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）和FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）在IPTG誘導的T7啟動子的控制下表達（圖2A，圖2B）。Western blot分析表明，重組蛋白FN3-epitopes能夠與所選抗體特異性結合（圖2C，圖2D）。

圖2. 重組FN3-Epitopes在大腸桿菌中的表達

注：（A, B）誘導1-6小時后，通過SDS-PAGE分析蛋白FN3-epitopes-4GS （A）和FN3-epitopes-polyN （B）的表達情況，箭頭所指為靶蛋白。（A, B）的右側為SDS-PAGE圖像的信號強度，數(shù)據(jù)為獨立實驗的平均值，誤差條表示標準差。（C, D）Western blot分析FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）在指定誘導時間點的表達情況，（C）和（D）分別使用HRP標記的NT-proBNP（表位13-20）和NT-proBNP（表位63-71）抗體。（A, B,C, D）中的M為Marker。

5.3FN3-Epitopes的純化

FN3-epitope在大腸桿菌中主要以可溶性形式表達（圖3A，圖3B）。在相似蛋白表達水平下，蛋白FN3-epitopes-4GS的純化效率明顯低于蛋白FN3-epitopes-polyN（圖3C，圖3D）。此外，為便于親和層析純化，研究人員進行了熱變性實驗，檢測不同溫度條件下（37-70℃）FN3-epitopes-polyN蛋白的降解水平。結果表明，隨著溫度的升高，F(xiàn)N3-epitopes-polyN蛋白逐漸從上清轉移到沉淀。在40℃下，大約30%的異源蛋白析出，而60%的目標蛋白仍存在于上清中（圖3E，圖3F；詳細信息見補充圖1）。利用這種熱穩(wěn)定性，研究人員優(yōu)化了純化工藝，將FN3-epitopes-polyN細胞裂解液的上清加熱到40°C，然后在進行金屬螯合層析，從而獲得更高質量的純化蛋白（~ 40mg/L）。SDS-PAGE結果顯示，重組蛋白FN3-epitopes-polyN的純度約為100%（圖3D）；這些蛋白無需進一步純化，可作為校準品或標準品。

圖3. 重組FN3-epitopes的溶解性和純化

注：（A,B）分別為大腸桿菌BL21（DE3）中表達的可溶性FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的SDS-PAGE和Western blot結果。箭頭所指為靶蛋白FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）或FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）。Lane 1為總蛋白裂解物的沉淀；Lane 2為總蛋白裂解液上清。（C, D）為通過HisTrap™分離純化FN3-epitopes-4GS（C）和FN3-epitopes-polyN（D）的SDS-PAGE結果。（C）中Lane 1-3的蛋白用60mM咪唑依次洗脫；（D）中Lane 1-3的蛋白用80mM咪唑依次洗脫。（E, F）為FN3-epitopes-polyN（E）和除FN3-epitopes-polyN外的其他蛋白（F）的熱降解直方圖，數(shù)據(jù)為獨立實驗的平均值，誤差條表示標準差。（A, B,C, D）中的M為Marker。

補充圖1. SDS-PAGE分析不同溫度條件下的熱降解檢測

注：目標蛋白用黑框圈出。上圖為上清液中總蛋白。下圖為沉淀物中的總蛋白質。M為Marker。

5.4FN3-Epitopes的抗原反應性

以野生型FN3為陰性對照，采用雙抗體夾心ELISA法系統(tǒng)評價重組FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS的免疫反應性。結果顯示兩種重組FN3-epitopes與特異性抗體均具有良好的線性關系，其中FN3-epitopes-polyN在0.06~12.85ng/ml范圍內，標準曲線r2大于0.99（圖4B, 補充圖2）。與FN3-epitopes-4GS相比，F(xiàn)N3-epitopes-polyN在低濃度下表現(xiàn)出更好的親和力。綜上所述，NT-proBNP的雙表位可以在FN3結構域上成功展示，并保持其原有的高抗原反應性。本研究重點分析了易于純化和親和力較好的重組蛋白FN3-epitopes-polyN。

圖4. 重組蛋白FN3-epitopes-polyN的免疫反應性和穩(wěn)定性檢測

注：（A）夾心ELISA方案。（B）夾心ELISA法檢測免疫反應性。捕獲和檢測抗體分別為NT-proBNP（表位63-71）和酶標NT-proBNP（表位13-20）抗體，底物溶液為TMB。（C）Western blot分析血清FN3蛋白（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的穩(wěn)定性。（D）DSC熱穩(wěn)定性檢測顯示，F(xiàn)N3-epitopes-polyN（Tm= 83.9°C）和野生型FN3（Tm= 84.9°C）具有相似的高Tm值。

補充圖2. 夾心ELISA檢測抗原反應性

注：捕獲抗體為NT-proBNP（63-71）抗體（3.5μg/mL），檢測抗體為酶標NT-proBNP（13-20）抗體（0.35μg/mL），底物溶液為TMB，檢出限為0.06ng/mL。

5.5FN3-Epitopes-polyN的體外穩(wěn)定性

為了明確兩個額外表位的融合是否對重組蛋白的穩(wěn)定性有影響，研究人員進一步驗證了FN3-epitopes-polyN的血清穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。體外重組蛋白FN3-epitopes-polyN的血清穩(wěn)定性檢測是在正常人血漿中進行的。結果表明，與非工程化FN3相似，在正常人血漿中37℃孵育80 h后，F(xiàn)N3-epitopes-polyN降解（圖4C）。DSC結果顯示，F(xiàn)N3-epitopes-polyN蛋白檢測只有一個單峰（Tm=83.9°C），且與野生型FN3的Tm值相近（Tm=84.9°C），說明純化后的FN3-epitopes-polyN蛋白保持了非工程化FN3的穩(wěn)定性（圖4D）。上述穩(wěn)定性試驗表明，重組蛋白FN3-epitopes-polyN將是NT-proBNP抗原的高度穩(wěn)定替代品。

6.總結

基于支架蛋白構建替代抗原是一種很有前景的成本效益優(yōu)化策略。本研究以N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）的兩個肽表位為例，提出了構建第10人纖維連接蛋白III型（FN3）替代抗原的策略。結果顯示，基于FN3支架構建的NT-proBNP替代抗原具有與NT-proBNP相同的免疫反應性、良好的生物物理特性和穩(wěn)定性；可以在大腸桿菌表達系統(tǒng)中快速高效地產生，相較于真核細胞表達或化學合成操作更簡單、成本更低。

參考文獻

Ruan Y, Chao S, Hu X, et al. FN3 Domain Displaying Double Epitopes: A Cost-Effective Strategy for Producing Substitute Antigens[J]. Front Mol Biosci, 2021,8:742617.?

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